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Unser FTICR-MS, ein Ionspec QFT-7 von Varian Inc. wurde im Oktober 2006 installiert. Ausgestattet mit entweder einer Micromass/Waters Z-Spray Elektrospray-Ionenquelle, einer Micromass/Waters Z-Spray APCI-Ionenquelle oder einer MS Horizons NSI-Ionenquelle sind an diesem Gerät Messungen mit extrem hoher Auflösung möglich. Auch sind neben verschiedenen, beeindruckenden Möglichkeiten zur Ionenmanipulation MSn-Messungen möglich.

Sowohl die Elektrosprayionisierung (ESI) als auch die Nanosprayionisierung (NSI oder nano-ESI) erlauben eine sehr schonende Ionisierung von polaren und ionischen Analyten welche in Methanol, 2-Propanol oder Acetonitril gelöst sind. Aceton und/oder THF und bis zu 50% Wasser oder 20% Dichloromethan bzw. Chloroform sind bei ESI tolerabel, während bei NSI bis zu 95% Wasser im Lösungsmittel verwendet werden können. Die Analyten sollten gegen Sauerstoff und Feuchtigkeit stabil sein. Leicht oxidierbare Analyten können während der Ionisierung oxidiert werden. Analyten mit höheren Molekulargewichten erscheinen häufig als mehrfach geladene Ionen. So werden bei Anlegen einer positiven Spannung (bei ESI wird eine Spannung von ca. 4 kV auf die Spraykapillare gelegt, bei NSI ca. 800 V ) sehr häufig vielfach geladene, kationisierte Ionen wie [M+nH]n+ bzw. [M+n(Cat1+)]n+ detektiert. Für APCI müssen alle Bestandteile der Probe inklusive Analyt flüchtig genug sein. Typischerweise werden hier [M+H]+ -Ionen gebildet.

Für alle Analysen sollten die Proben möglichst sauber sein. Speziell oberflächenaktive Substanzen wie z.B. SDS oder auch anorganische Salze unterdrücken die Ionisierung der eigentlich interessanten Spezies.

Die Quadrupolregion des Massenspektrometers erlaubt es, gezielt Ionen vorzuselektieren und zu speichern. Auch können hier Experimente mit Kollisions-induzierter Fragmentierung (CID) durchgeführt werden, bevor die Ionen in den supraleitenden Magneten (Feldstärke B: 7 T) transferiert werden.

Die Quadrupole sowie die Transferhexapole sind auch die limitierenden Faktoren für den Massenbereich: die höchsten detektierbaren Masssen überschreiten ein m/z 6,500 nicht wesentlich. Ionen mit höherem m/z - Verhältnis können allerdings bei der Fragmentierung von sehr hoch geladenen Ionen in der ICR-Zelle entstehen und detektiert werden. Die ICR-Zelle (Ionen-Zyklotron-Resonanz-Zelle) ermöglicht eine Vielzahl verschiedener Fragmentierungsmethoden wie BIRD, ECD, IRMPD und SORI-CID. Zusätzliche Puls- und Leckventile erlauben Gasphasenreaktionen der gespeicherten Ionen mit Gasen und leicht flüchtigen Flüssigkeiten und H/D-Austauschexperimente. So ist uns der Zugang zu einer Vielzahl von Möglichkeiten zur Strukturaufklärung, Untersuchung von Reaktionsmechanismen und zur Studie von thermodynamischen Daten der Analyten gewährleistet. Eine limitierte Anzahl von speziell ausgebildeten Nutzern kann das Gerät neben dem Servicepersonal betreiben. An zwei Rechnern in Raum 13.06 steht die Auswertesoftware zur Verfügung.  

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Als GC-MS steht uns ein 5977E MSD (Single-Quadrupol) mit einem 7820A GC-System der Firma Agilent Technologies zur Verfügung. Es besteht aus einem Gaschromatographen, der mit einer Trennsäule ausgestattet ist, die zur Trennung von Stoffgemischen aus unpolaren Lösungsmitteln wie z.B. Hexan oder Ethylacetat geeignet ist. Die Analyse von Gemischen aus wässrigen Lösungen oder bei Verwendung von hochsiedeneden Lösungsmitteln zerstören das Injektionssystem sowie die Trennsäule und ist daher an diesem Gerät nicht möglich.

Die Proben müssen salzfrei sein und dürfen ausschließlich leicht flüchtige Verbindungen, die nicht mit dem Material des Injektors oder der Trennsäule reagieren, enthalten. Als Lösungsmittel werden THF, Diethylether, Ester sowie Hexan oder Pentan vorgeschlagen. Wasserhaltige Proben können wie oben bereits erwähnt nicht untersucht werden.

Da die Ionisierung mittels Elektronenstoß (EI) nach der Trennung erfolgt, ist eine Grundvoraussetzung für die Ionisierung bereits gegeben: die Analyten liegen bereits gasförmig vor. Als Folge aus der Ionisierungsmethode werden auch hier einige strukturtypische Fragmentionen mit gerad- oder ungeradzahliger Elektronenanzahl sowie das M*+ - Radikalion gefunden. Durch den verwendeten Analysator, einem Quadrupol, sind nur Messungen bei niedriger Auflösung möglich (R ≈ 1.000). Weiterhin limitierend ist der eingeschränkte Massenbereich von ca. m/z 20 bis zu 650. Dieser Nachteil wird teilweise durch einen automatisierbaren Abgleich der generierten Daten mit einer integrierten Datenbank kompensiert.

Nach einer Einweisung und etwas Training kann das Gerät von den Nutzern selbst betrieben werden (Open-Access-Gerät).

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Ein HPLC-MS ist ebenfalls im Betrieb. Es ist ein Agilent 6210-System, bestehend aus einem analytischen Agilent 1100 HPLC-System mit einem zusätzlichen Diodenarraydetektor (DAD) sowie einem ESI-MSD TOF von Agilent Technologies.

Es ermöglicht Messungen mit hoher Auflösung und sehr hoher Massenpräzision. Der Fehler ist unter 5 ppm bei externer und unter 2 ppm bei interner Kalibrierung. Die interne Kalibrierung wird durch einen zweiten, zum Hauptsprayer orthogonal angeordneten Sprayer gewährleistet (Lockspray). Der Massenbereich (m/z 50 bis 3,500) bedeutet, dass nahezu jede polare oder ionische Verbindung detektiert werden kann, da ESI (Elektrosprayionisierung) genutzt wird, um das HPLC-System mit dem Massenspektrometer zu verbinden. Für Analyten mit höherer Masse werden auch hier im positiven Ionisierungsmodus (eine Spannung von ca. 4 kV wird an der Eingangskapillare angelegt) die Bildung von mehrfachgeladenen, kationisierten Ionen der Art [M+nH]n+ bzw. [M+n(Cat1+)]n+ beobachtet. Auch hier sollten die Proben möglichst sauber sein. Alle anderen Vorbedingungen sind bereits in dem Abschnitt über FTICR beschrieben worden.

Experimente mit Direktinfusion werden von trainierten Nutzern sowie dem Servicepersonal durchgeführt. Dabei sollten nur gefilterte (4 µm Filter) Analytlösungen untersucht werden. Auch sollte die Analytkonzentraion zur Vermeidung von Verschleppung sowie zur Vermeidung von Verschmutzungen des Instruments sowie um den Detektor zu schonen möglichst gering gehalten werden. Eine maximale Konzentration von 100 µmol/L wird gestattet. Die maximal erlaubte Zahl für die Counts ist 1,000,000 (106)! Wenn höhere Counts detektiert werden, muss die Probe sofort verdünnt werden! Positiver Nebeneffekt dieser Vorgehensweise ist, dass durch Vermeidung der Detektorsättigung die Massengenauigkeit deutlich größer ist.

LC/MS-Messungen können von eingewiesenen Nutzern selbstständig durchgeführt werden. Zusätzlich zu den Voraussetzungen für Direktinfusion ist bei diesen Experimenten zu bedenken, dass die Proben für die HPLC-Trennung geeignet sind. Reaktionen der Analyten mit dem Säulenmaterial sowie ein Verbleib auf der Säule sind nicht tolerierbar. Der pH aller Proben sowie der verwendeten Lösungsmittel muss in einem Bereich von ph 7 bis pH 4 liegen. Als Puffer sind alle leicht flüchtigen Puffer mit Anionen wie z.B. Carbonat, Acetat ode Formiat sowie Kationen wie Ammonium, Triethylammonium und so weiter verwendbar, allerdings mit einer Maximalkonzentration von 10 mmol/L. Nicht verwendet werden dürfen Puffer mit schwer flüchtigen Bestandteilen wie unter anderem Phosphat, Sulfat, Na+ oder K+.

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EI-MS
EI-MS
Bildquelle: Dr. A. Springer

Ab Mitte Juli 2015 werden wir unseren Service erweitern können. Das MAT 711, von der Firma Varian MAT in den Siebzigern des vorigen Jahrhunderts gebaut, konnte nach über vierzig Jahren durch ein moderneres Gerät, einem Autospec Premier der Firma Waters, ersetzt werden. Neben EI stehen noch CI und LIFDI bzw. FI (letztere Ionenquelle von Linden CMS) zur Ionisierung zur Verfügung. Auch können Analytgemische vor der massenspektrometrischen Analyse mittels Gaschromatographie aufgetrennt werden.

EI

Wenn EI (Electron Impact, Elektronenstoßionisierung) zur Ionisierung genutzt wird, ist in den erhaltenen Massenspektren neben den charakteristischen Fragmentionen (Ionen mit gerad- oder ungeradzahliger Elektronenzahl), die oft Rückschlüsse auf die chemische Struktur erlauben, oft auch das M*+-Radikalion zu finden. Einige wenige Verbindungen bilden auch stabile Radikalanionen, so dass sich auch Messungen bei umgekehrter Polarität anbieten können. Da die Probe auch bei dieser Ionisierung zunächst verdampft werden muss, sind wir auf Analyten mit einem Siedepunkt (Sublimationspunkt) von unter 350°C im Vakuum limitiert.

CI

Bei CI (Chemischer Ionisierung) werden meist die protonierten, geschlossenschaligen Ionen ([M+H]+) bei der Verwendung von Methan als Badgas gebildet. Die Ionisierung ist deutlich sanfter als mittels EI, es sind aber normalerweise immer noch Fragmentionen zu detektieren, zusätzlich noch Ionen, die aus dem Badgas oder Reaktionen des Badgases mit den Analyten entstehen. Auch hier muss Probe zunächst verdampft werden, (Siedepunkt/Sublimationspunkt von unter 350°C im Vakuum). Auch hier ist die Messung von negativen Ionen (NCI) möglich.

LIFDI

Nach einer Einarbeitungszeit wird das angebotene Methodenspektrum noch um eine spezielle Form der FD (Feld-Desorption), LIFDI, sowie um FI (Feldionisation) erweitert. Die dafür notwendige alternative Ionenquelle wird von Linden CMS geliefert. Diese Methode wird insbesondere die Analyse von oxidations- oder feuchtigkeitsempfindlichen Substanzen erleichtern. Meist werden, wie bei EI, die M*+-Radikalionen, teilweis ebegleitet von Fragmentionen, gebildet. Durch eine sanftere Ionisierung ist unter anderem die Analyse von Organometallverbindungen möglich. Außerdem ist bei dieser Ionisierungsmethode die Volatilität des Analyten weniger entscheidend als bei EI und CI.

Allgemeines zum Gerät

Diese Messungen finden standardmäßig bei niedriger Auflösung statt, R ist ungefähr 1000. Um gute Ergebnisse zu erhalten und um Schaden am Gerät zu vermeiden ist es unabdingbar, flüssige oder feste Reinsubstanzen als Proben abzugeben. Bei Messungen dieses Typs ist nur die erste Nachkommastelle signifikant.

Messungen mit Hochauflösung (bis zu R = 80.000) sind möglich, aber aufwendiger. Eine ausreichende Intensität des zu untersuchenden Ions ist Grundvoraussetzung. Es kann jeweils nur ein Ausschnitt des Spektrums hochaufgelöst analysiert werden (etwa eine Dekade). Die Massenabweichung zwischen theoretischer und gefundener Masse ist typischerweise unter 5 ppm.

Kopplung mit GC

Bei ausreichend flüchtigen Analytgemischen ist es möglich, vor die Analyse mittels Massenspektrometrie eine Trennung mittels Gaschromatographie vorzuschalten (Vorbedingung hierfür: gesamte Probe rückstandslos verdampfbar bei unter 300°C und der Verwendung leichtflüchtiger Lösungsmittel wie z.B. Hexan oder Ethylacetat, Messungen aus Wasser oder hochsiedenden Lösungsmitteln sind leider nicht möglich).

Wer kann das Gerät nutzen?

Die Messungen an diesem Gerät werden vorwiegend vom Servicepersonal durchgeführt. Bei längeren Forschungsarbeiten, deren Kern die Nutzung dieses Geräts voraussetzt, ist eine selbstständige Nutzung nach einer entsprechenden Einweisung möglich.

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Mit dem ESI-IMS-MS/MS, ein UPLC-Synapt G2-S HDMS der Firma Waters, ist ein neues Gerät in das Kernkompetenzzentrum für Massenspektrometrie eingezogen. Es wird derzeit in Betrieb genommen (Stand: Januar 2012). Nach einer gewissen Einarbeitungszeit wird es auch für Servicemessungen bzw. zur selbstständigen Nutzung durch wenige Arbeitsgruppen zur Verfügung stehen. Die Anlage besteht aus zwei aneinander gekoppelten Geräten:

  1. Einem sehr leistungsstarken Chromatographiesystem, einer Acquity UPLC.

    Diese besteht aus einem binären Pumpensystem, was Drücke bis zu 1000 bar (15000 psi) erlaubt. Damit steht der Nutzung von Säulenmaterial mit sehr kleinen Partikelgrößen (bis 1,7 µm) und damit sehr effizienten und schnellen Trennungen nichts mehr im Wege.

     Weitere Bestandteile sind der auf 4°C temperierbare Autosampler, ein Säulenofen sowie ein Photodiodenarraydetektor (PDA), mit dem Wellenlängen im sichtbaren und UV-Bereich des Lichtspektrums detektiert werden können.

     Bedingt durch die Kapillaren mit sehr kleinem Innendurchmesser sowie die kleinen Partikelgrößen des Säulenmaterials können nur speziell gefilterte Eluenten und Proben verwendet werden, um eine Verstopfung zu vermeiden.

  2. Einem ESI-IMS-MS/MS (Synapt G2-S HDMS).

    Das Hybridgerät beinhaltet vereinfacht gesagt ein Q-TOF mit einem Ionenmobilitätsspektrometer. Als Optionen für die Ionisierung stehen uns derzeit eine Z-Spray-ESI-Ionenquelle sowie eine NSI-Ionenquelle zur Verfügung. Beide sind mit einem zweiten Sprayer (Lockspray) ausgestattet, was eine externe Kalibrierung während der Messungen und damit eine sehr gute Massengenauigkeit (ca. 1 ppm) gewährleistet. Die Auflösung des Flugzeitmassenspektrometers (TOF) ist mit ca. 40.000 sehr hoch. Interessant ist auch der sehr große Massenbereich (m/z > 30.000), wodurch auch sehr große, nonkovalent gebundene Komplexe einer Analyse zugänglich gemacht werden können. Ein weiterer Vorteil des Geräts ist die Ionenmobilitätszelle. Hier können die Ionen nicht nur nach ihrem m/z, sondern auch nach dem Stoßquerschnitt getrennt werden. So ist neben einer sehr schnellen Trennung hochkomplexer Analytgemische z.B. auch eine Auftrennung verschiedener Isobaren möglich. Als Beispiel seien hier Peptide mit reversen Sequenzen genannt. Das IMS ist aber auch im Bezug auf die experimentelle Bestimmung der Driftzeiten und damit der Stoßquerschnitte der analysierten Ionen interessant.

    In den Massenspektren sind bei Nutzung von ESI oder NSI vor allem die kationisierten Ionen, [M+H]+ oder [M+(Cat1+)]+ sowie mehrfach geladene Ionen zu finden. Fragmentionen sind eher eine Ausnahme. Bedingt durch die sehr hohe Empfindlichkeit des Geräts wird auch hier chemisches Rauschen zum Untergrundspektrum beitragen. Die Grundanforderungen an die Proben werden größtenteils identisch zu denen sein, die in den Unterpunkten FTICR-MS bzw. HPLC-MS erwähnt sind.

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Die UPLC und das HPLC-System sind beide zusätzlich mit einem DAD-Detektor ausgestattet. Bei beiden Geräten kann eine Standard-Trennsäule (RP, C18) des jeweiligen Herstellers mit angeboten werden. Für speziellere Anwendungen können ggf. auch Trennsäulen des jeweiligen Nutzers verwendet werden. Daneben stehen für das ESI-IMS-MS/MS und das ESI-FTICR-MS auch noch Nano-ESI-Quellen zur Verfügung, diese können aber ausschließlich offline, d.h. ohne Kopplung an eine Trennmethode, genutzt werden.

Eine limitierte Anzahl von speziell ausgebildeten Nutzern kann das Gerät neben dem Servicepersonal betreiben. An zwei Rechnern in Raum 13.06 steht die Auswertesoftware zur Verfügung.