Methoden

 

Rasterelektronenmikroskopie

Raster-Elektronenmikroskop (REM) dient der Darstellung mikromorphologischer Strukturen, die kleiner als 0,001 mm (=1 µm) sind. Anstelle von Lichtwellen nutzt es Elektronenwellen, mit denen es die Oberflächen von Objekten abtastet. Im Vakuum der Probenkammer trifft ein Elektronenstrahl auf die Probe und erzeugt Sekundärelektronen, die von Detektoren registriert und in elektronische Signale umgewandelt werden. Diese Abbilder können auf Monitoren direkt abgebildet und digital untersucht werden.
Pollen, Kieselalgen und Blätter gehören zu den häufigsten Objekten, deren Oberflächen im REM auf Wachse, Haare oder auffällige Strukturen untersucht werden. Oft helfen kleine morphologische Unterschiede bei der Unterscheidung von Arten.
 

Lichtmikroskopie

Damit Objekte mit Hilfe eines Licht-Mikroskops so hoch wie möglich vergrößert werden können, muss das Licht optimal hindurch dringen. Deshalb werden sie sehr dünn geschnitten oder gequetscht. Aus besonders kleinen Objekten wie Kieselalgen entstehen Streupräparate.
Die Anzahl der Chromosomen einer Pflanze bestimmt man in Geweben mit besonders vielen Kernteilungen wie zum Beispiel Wurzelspitzen. Das Gewebe wird zunächst in einer sauer reagierenden Lösung mazeriert, gefärbt und unter leichtem Druck zwischen Objektträger und Deckglas gequetscht, bis es sich in einzelliger Schicht ausgebreitet hat.
Um die Anatomie von Pflanzenorganen wie etwa Blüten oder Samen zu analysieren, bettet man diese in ein geeignetes Medium wie etwa Wachs, Eis oder Kunststoff ein und schneidet sie mit einem Mikrotom. Diese hauchdünnen Schnitte werden dann auf Objektträger aufgereiht, gefärbt und mit einem Deckglas zu einem Dauerpräparat verklebt.
 

Isolation von DNA

Die DNA (Deoxyribo Nucleid Acid) ist die Hauptträgerin der Erbinformation aller Lebewesen. Sie ist ein Doppelmolekül, das wie eine schraubenförmig gewundene Leiter oder Doppelhelix geformt ist. DNA besteht neben einem Zuckerphosphat-Rückgrat aus vier Bausteinen, den Basen Adenin, Cytosin, Guanin und Thymin. Die Abfolge der Basen eines Genomabschnittes, Sequenz genannt, ist häufig charakteristisch für Arten oder sogar Individuen. Bestimmte DNA-Abschnitte, die Gene, enthalten „Baupläne“ für Proteine oder für Moleküle zur Proteinsynthese. Je nach Organismenart ist sie bei der Zellteilung auf eine unterschiedliche Anzahl von Chromosomen verteilt. Außer im Zellkern finden sich kürzere DNA-Moleküle in den „Kraftwerken der Zelle“, den Mitochondrien; bei Algen und Pflanzen auch in den Lichtenergie nutzenden Chloroplasten. Um die DNA zu isolieren werden Gewebeproben getrocknet und zerkleinert. Nacheinander werden die Zellinhaltsstoffe aufgeschlossen und teilweise mit Hilfe von Enzymen abgebaut. Proteine und Polysaccharide werden ausgefällt und zusammen mit Zell- und Geweberesten mit Hilfe einer Zentrifuge entfernt. Danach wird die Roh-DNA an ein Trägermaterial gebunden, alkoholisch gereinigt und als reine DNA in einem wässrigen Puffer gelöst. Sie kann nun direkt analysiert werden und steht für weitere Untersuchungen langfristig zur Verfügung.
 

Der genetische Fingerabdruck

DNA kann man mit Hilfe von Enzymen in Stücke verschiedener Länge zerschneiden. Werden diese Teilstücke nach ihrer Größe aufgetrennt, entsteht ein individuell einzigartiges Muster: der genetische Fingerabdruck. Je ähnlicher die Muster zweier Lebewesen sind, desto näher sind sie miteinander verwandt.
Bei AFLP werden die DNA-Stränge zunächst mit Restriktionsenzymen zerkleinert. Anschließend wird ein Teil der DNA-Stücke mit Hilfe der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) vervielfältigt und mit geeigneten Farbstoffen markiert. Anschließend wird diese Mischung von DNA-Abschnitten im elektrischen Feld mittels Kapillarelektrophorese nach ihrer Größe getrennt. Das entstandene Muster kann in eine Zahlentabelle übersetzt und statistisch ausgewertet werden.
Der genetische Fingerabdruck eignet sich besonders gut zum Vergleich nahe verwandter Organismen. Mit seiner Hilfe kann man innerhalb von Arten verschiedene Unterarten, Sorten oder Populationen unterscheiden.
                           

Die Polymerase-Kettenreaktion (PCR)

Der Amerikaner Kary Mullis erfand im Jahr 1983 die Methode der Polymerase-Kettenreaktion (Polymerase Chain Reaction = PCR). Damit können selbst geringste Mengen DNA, auch wenn sie aus sehr alten Gewebeproben oder aus gut erhaltenen Fossilien stammen, künstlich millionenfach vervielfältigt werden. Mullis wurde dafür 1993 mit dem Nobelpreis für Chemie geehrt.
Genau festgelegte DNA-Abschnitte einer Probe können mit Hilfe der PCR kopiert werden. Zunächst wird dazu die doppelsträngige DNA in Einzelstränge getrennt. Danach lagert sich die zugegebene künstliche Start-DNA, auch Primer genannt, an die Einzelstränge an. Im dritten Schritt vervollständigt die DNA-Polymerase, diese Einzelstränge mit Hilfe von ebenfalls hinzugefügten einzelnen DNA-Bausteinen zu identischen Doppelsträngen. Wird dieser Vorgang wiederholt, kann die Ausgangs-DNA in wenigen Umläufen exponentiell vermehrt werden. Auf diese Weise kann sogar eine sehr kleine DNA-Menge, wie sie in wenigen Pollenkörnern oder nur in einer Zelle enthalten ist, so weit vervielfältigt werden, dass eine genauere Untersuchung möglich ist.
 

Qualitätsprüfung

Für erfolgreiche Analysen von DNA ist es wichtig, die Qualität und Quantität der isolierten DNA-Proben einzuschätzen. Außerdem muss bei jedem Arbeitsschritt zur Bestimmung des genetischen Fingerabdrucks und der DNA-Sequenz kontrolliert werden, ob die eingesetzten molekularen Methoden erfolgreich waren. Deshalb wird die Qualität der DNA-Proben mit Hilfe von Agarose-Gelelektrophorese und Absorptionsspektroskopie getestet.
Agarose-Gelelektrophorese trennt die DNA-Moleküle bei ihrer Bewegung im elektrischen Feld nach ihrer Größe. Die Größe der isolierten DNA ist ein Maß für ihre Qualität.
Mit Absorptionsspektroskopie wird die Reinheit einer DNA-Probe überprüft. Hieraus kann zudem die Quantität der DNA in der Probe berechnet werden.
 

DNA-Sequenzanalyse nach Sanger

Die DNA-Sequenzanalyse nach Frederick Sanger wird genutzt um die genaue Basenabfolge eines DNA-Moleküls zu bestimmen und weitgehend automatisiert durchgeführt. Dazu wird eine Probe mit vervielfältigten DNA-Abschnitten wieder in Einzelstränge getrennt. Im Unterschied zu der PCR vervollständigt die DNA-Polymerase jedoch nur jeweils einen DNA-Strang. Das Gemisch aus Einzelbasen, die zugesetzt werden, enthält zudem chemisch veränderte Basen (ddNTP) die mit unterschiedlichen Fluoreszenz-Farbstoffen (A, G, C oder T) markiert sind.
Die entstandenen Produkte mit den unterschiedlichen Fluoreszenzsignalen werden elektrophoretisch nach Größe getrennt. Das entstandene Signal wird als Elektroferogramm farbig dargestellt und gibt die Abfolge der Basen des sequenzierten DNA-Abschnittes direkt wieder.
 

Next Generation Sequencing

In den letzten Jahren wuchs das Interesse von Wissenschaftlern, das gesamte Erbgut von Organismen zu entschlüsseln. Ihr Ziel ist es, die „Baupläne des Lebens“ und die auf ihnen beruhenden biologischen Prozesse besser zu verstehen. Zugleich wurden neue Techniken entwickelt und die bestehenden Verfahren enorm beschleunigt. Sie werden als Hochdurchsatz-Sequenzierung oder Next Generation Sequencing (NGS) bezeichnet.
Die Methoden der NGS sind so leistungsfähig, dass bei einem Durchlauf einer Probenplatte bis zu 520 Millionen Basen auf einmal identifiziert werden können. Die ermittelten Sequenzen beruhen auf kurzkettigen DNA-Abschnitten, die vielfach miteinander überlappen. Um ein Genom zu entschlüsseln, werden sie mit Hilfe großer Rechnerkapazitäten ähnlich wie bei kryptographischen Verfahren solange zusammengesetzt, bis eine vollständige Version rekonstruiert ist.